稳定的细胞内环境是细胞维持生物功能和进行生理活动的前提，细胞内环境物理参数，如细胞内压、细胞内部密度和弹性的测量可以为探索细胞生理活动的深层机制创造条件。当前的细胞内环境的研究主要集中在细胞内结构和化学成分的研究，而对细胞内环境参数的检测还相对较少。目前细胞的弹性、重量和细胞内压的测量需要原理不同的专门的仪器完成，因此无法使用同一设备对细胞的多个参数进行检测，进而分析各个参数对细胞生理活动综合影响。课题组利用显微操作机器人系统，进行细胞弹性、重量和内压三参数的自动化原位检测。具体的每个参数的检测介绍如下：
图1 传统细胞弹性（a-e）、重量（f-h）和内压（i-l）测量方法
批量自动化细胞弹性测量系统
通过与注射器相连的传输微管自动推动卵母细胞进入视野，通过图像检测对细胞粘连进行检测（图2a），进而使用测量针深入传输微针吸住细胞表面（图2b），传输针施加负压实现自动破粘连（图2c）；进一步的测量微针离开传输针，自动吸持卵母细胞并测量细胞形变，最终获得细胞弹性数值（图2c）。整个机器人化细胞操作流程如图2所示:
图2 批量机器人化细胞弹性测量流程
基于细胞旋转检测的细胞重量测量方法
根据自动定位的细胞核注射针与吸持针位置。控制吸持针和注射针将细胞抬起并释放，在细胞下落过程中自动化聚焦细胞，根据光流法测量细胞的下落过程中的旋转程度，根据聚焦平面的实时位置获得选择不旋转的细胞的下落速度计算细胞重量。
图3 机器人化细胞重量测量方法
基于改进平衡压模型的细胞内压测量方法
细胞内压是细胞内环境的重要组成部分，细胞内压的测量不仅有助于揭示细胞生理活动的机理，同时也能够提高细胞微操作的精度。目前对细胞内压的探索有些依赖专用的仪器，有些会影响细胞活性。课题组提出了一种基于改进平衡压模型的机器人化细胞内压测量方法，使细胞内压的测量步骤可被集成于传统细胞微操作的流程中。此方法利用注射微管刺入卵母细胞后微管口的液体来感知细胞气压。根据改进的平衡压模型，细胞内压对微管口液体施加的力可由气液交界面状态和细胞的形变计算出，如图4所示。根据此模型设计的机器人化流程在细胞刺入过程中实时检测气液交界面位置，夹角和细胞形变等参数，由此计算细胞内压，如图5和录像1所示。在猪卵母细胞上的内压测量实验表明该方法对平均每个细胞的操作速度为12秒，成功率为80%，操作后的细胞在后续的培养中有87.5%的成活率，证明此测量方法对细胞的伤害有限。上述工作已经发表在IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement杂志上(Qiu Jinyu, Zhao Qili*. IEEE-TIM, Vol.73, No. 4003209, 2024)。
图4 改进平衡压模型示意图
图5 细胞形变实时检测
录像1 气液交界面状态实时检测
基于微量移液管电极的机器人细胞内压测量方法
课题组使用传统的微量移液管电极系统（图6），对所测量的微量移液器在培养基内的电阻进行建模，分析当微量移液器内的压力增加时其变化趋势。然后，根据测试的电极电阻-压力关系确定适合细胞内压力测量的微量移液器电极内填充的KCl溶液的浓度。此外，对细胞内的微量移液管电极的测量电阻进行建模，以通过释放细胞内压力前后的内压差来测量细胞内压力，并建立了基于传统微吸管电极系统的细胞内压力机器人测量程序，如图7和图8所示。对猪卵母细胞的实验结果表明，该方法的平均操作速度为20-40 cells/day，测量效率与相关工作相当。测量的电极电阻与微管电极内部压力之间的平均重复误差小于5%，并且在测量过程中没有发现可观察到的细胞内压力泄漏，这两者都保证了细胞内压力的测量准确性。猪卵母细胞的测定结果与文献报道的结果一致。此外，测量后获得了90%的手术卵母细胞存活率，证明对细胞活力的损伤有限。该工作已经发表在Sensors杂志上(Li Minghui, Zhao Qili*. Sensors, 23(10): 4973, 2023)。
图6 微管电极制作 (a)电极夹持器 (b)玻璃管拉拔成直径约为2μm的锥形尖端 (c)微管尖端弯曲30 °
图7 细胞内微管电极的电阻分布 (a)刺入细胞的测量微管电极电路 (b)刺入细胞的微管电极中的离子浓度分布
图8 细胞内压力测量结果 (a)微管电极在释放细胞内压力前穿透细胞 (b)微管电极在释放细胞内压力后穿透细胞 (c)~(d)第一准稳态下的电阻值和相应的压力 (e)~(f)第二准稳态下的电阻值和相应的压力
基于气压变化模型的机器人化无视觉细胞转运方法
细胞转运是许多生物应用中的关键步骤。目前，大多数细胞转运研究都依赖于显微视觉反馈，这限制了其在无法获得显微视觉的地方的应用。课题组首次提出一种基于气压变化模型的机器人无视觉细胞转运方法。制作了一种双层微吸管，通过将一个薄的微吸管套入一个厚的微吸管中制成，如图9所示。在细胞转运过程中，外层微管拾取靶细胞，内层微吸管固定靶细胞。为实现这一点，基于力分析来确定拾取和放置细胞的适当流体力。然后，基于微吸管抽吸模型确定了合适的内细微吸管内径。此外，建立了双层微移液器在保持和释放过程中内部压力变化的模型，并进行了机器人显微视觉验证，如图10所示。实验结果表明，该系统能够以平均每个细胞25s的速度转运斑马鱼胚胎，转运成功率为90%，转运效率与显微视觉反馈的相关方法相当。此外，通过培养实验证实了机械损伤对斑马鱼胚胎发育能力的影响可忽略不计。上述工作已经发表在IEEE Transactions on Automation Science and Engineering (Qiu Jinyu#, Zhu Ripeng, Zhao Qili*. IEEE-TASE, 10.1109/TASE.2024.3407841,2024)。
图9 双层微量移液器的显微图像及宏观图像
图10 无视觉反馈的的细胞转运过程。(a)-(c)显微镜下的细胞吸持和释放过程。(d)吸持过程中双层微管内的压力变化。(e)每隔三个压力采样间隔计算一次的细胞吸持过程中的压力变化速度。(f)在释放细胞的过程中，双层微吸管中的压力变化。(g)每隔三个压力采样间隔计算释放细胞过程中的压力变化速度。
