图4 面向清醒动物脑科学研究的机器人化主动膜片钳系统研究内容

2.基于气压-电压联合全膜片驱动的平稳高阻封接技术 

膜片钳技术能够测量皮安级别的离子通道电流，这得益于细胞膜与玻璃壁能够形成紧密封接隔绝外部环境的噪声，使流过电极的电流主要来源于离子通道。这种紧密贴附结构的电阻能够达到吉欧以上，被称为“高阻封接”，是影响膜片钳记录成功率和信噪比的关键，如图9所示。然而，当前的膜片钳操作主要利用手动施加吸持气压来形成高阻封接，难以保证高阻封接的成功率和封接质量，限制了膜片钳技术的效率和广泛应用。课题组提出了一种气压与电压共同驱动的膜片钳高阻封接方法。首先，气压和电压在封接过程中对膜片施加的力被分别建模，并基于此建立了封接过程中膜片的动力学模型，如图9所示。根据动力学模型，一个双输入的自适应滑模控制器被设计用来控制封接过程中封接电阻的轨迹。脑片神经元的膜片钳实验表明，该方法相比于手动封接和PID控制器有更高的成功率和更高的封接阻值，更高质量的封接也提高了该方法的稳定记录时长，如图10和图11所示。上述工作已经发表在IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement杂志接收(Jinyu Qiu, Qili Zhao*. IEEE TIM)。 

  

图9 气压电压双驱动高阻封接动力学模型

  

3.基于穿孔物质主动释放控制的定量破膜技术

为了提高破膜的效率，课题组提出使用化学物质穿孔破膜的方式代替传统气压破膜，提出了一种基于穿孔物质主动释放控制的机器人穿孔膜片钳方法。目前穿孔物质的释放仍采用被动方案，穿孔过程时间较长，且穿孔物质在微管口的聚集会对高阻封接产生不利影响，这大大降低了穿孔膜片钳实验的效率。针对这一问题，实验室开发了一套基于穿孔物质主动释放控制的机器人穿孔膜片钳系统。首先，设计开发了一种新型侧面深入式三通道微管夹持器，该模块集成了独立驱动的穿孔物质传输通道，如图12所示。然后，通过穿孔物质释放试验，确定了响应速度更快、稳定性更高的液压驱动模式。根据菲克定律对孔道开口处穿孔物质的浓度梯度场进行建模，防止穿孔物质在高阻封接形成过程中误释放。此外，建立了在线检测穿孔程度的细胞穿孔电路模型，通过阶跃输入下跨膜电流峰值对穿孔程度进行反馈，从而物质释放进行闭环反馈控制，如图13和录像3所示。小鼠脑切片锥体神经元的实验结果表明，与传统的被动释放穿孔物质的方法相比，该系统能够以几乎两倍的吞吐量穿孔细胞膜，成功率提高57%。与传统的无孔全细胞膜片钳法相比，由于对高阻封接的负面影响较小，几乎没有细胞内容物损失，我们的方法操作的神经元的信号记录时间增加了一倍，如图14所示。上述工作已经发表在IEEE Transactions on Automation Science and Engineering杂志上(Chaoyu Cui, Qili Zhao*, IEEE TASE, 14(8): 5170-5181, 2024)。

图12 侧面深入式三通道微型夹持器

图13 细胞穿孔电路模型

录像3 基于跨膜电流峰值的闭环穿孔破膜过程录像

图14 穿孔膜片钳实验流程。(a)微针定位。(b)神经细胞定位。(c) 高祖封接形成。(d)释放穿孔材料后5分钟的跨膜电流峰值。(e)跨膜电流峰值随时间的变化曲线。

4.基于囊泡破裂控制的精准内面朝外膜片剥离技术

在单通道膜片钳技术中，课题组进行了内面朝外模式膜片钳技术的研究，提出了一种针对贴壁细胞的基于囊泡破裂控制的机器人内面朝外膜片钳方法。课题组首次提出了一种针对贴壁细胞的基于囊泡破裂控制的机器人内面朝外膜片钳系统，如图15所示。首先，课题组建立了基于跨膜电流响应的阻抗模型，用于检测囊泡破裂状态，如图16所示。随后，基于离焦成像模型对囊泡出入液的时间进行检测，并基于出入液时刻对微管的液外运动轨迹进行设计，从而精确控制囊泡在空气中的暴露时间，如录像4和图17所示。实验表明，暴露时间对囊泡破裂有显著影响。在此基础上，基于囊泡破裂控制建立了针对贴壁细胞的机器人内面朝外膜片钳操作流程如录像5所示。实验结果表明，课题组提出的机器人内面朝外膜片钳系统能够以100%的成功率检测囊泡破裂状态，暴露时间控制误差平均为0.02秒，操作HEK-293细胞的成功率为70%，平均操作速度为61.3秒/细胞。相比手动操作，成功率具有显著优势，为后续单离子通道功能研究奠定了坚实基础。上述工作已经在线发表在IEEE Robotic Automation Letters杂志上(Liu Yuzhu, Zhao Qili*. IEEE RAL, 10(3): 3014-3021, 2024)。

图15 基于囊泡破裂控制的机器人内面朝外膜片钳系统

图16 囊泡电路模型示意图

录像4 基于离焦成像模型的微管出入液检测过程

图17 微管在液体外暴露过程轨迹规划示意图

录像5 机器人化内面朝外膜片钳过程

5.基于组织环境应变交互建模的机器人化双臂膜片钳技术

  

  课题组提出了一种基于交互力学建模的机器人化双电极膜片钳系统，用于研究脑片中神经元之间的功能连接。首先，建立了双微管电极在粘弹性脑组织环境中分别接近目标细胞的交互力学模型，用于估计细胞的动态漂移。基于该模型，设计了微管同步下降策略、细胞对之间的相对位置以及双微管的在线轨迹规划，以减小细胞的动态漂移，如图18所示。最后，结合上述方法提出了一种机器人化双电极膜片钳操作流程，用于脑切片中神经元对之间功能连接测量，如图19和录像6所示。课题组在小鼠脑片初级视皮层的60个锥体神经元上进行实验。结果表明，与传统人工方法相比，本方法在成功率上提升了40%，在操作速度上提升了 38%。利用这些优势，实验中通过不同电刺激协议同时获得了突触前和突触后之间的多种电生理信号，包括突触前细胞的动作电位（APs）引发突触后细胞的兴奋性突触后电位（EPSPs）和突触前细胞的离子通道电流引发突触后细胞的兴奋性突触后电流（EPSCs），如图20和录像7所示。系统显著提高了脑切片中神经元之间的功能连接测量效率，因此该方法在未来有可能应用于神经疾病模型中突触连接异常的定量评估和新型药物或神经调控手段对神经环路功能影响的验证。上述工作已经被IEEE Transactions on Automation Science and Engineering杂志接收(Biting Ma, Qili Zhao*. IEEE TASE)。

图18 目标细胞漂移分析与微管电极轨迹设计。（a）在选择不同目标细胞对时，细胞的漂移方向与幅值。（b）微管电极沿 Z 轴下降时目标细胞漂移分析的示意图。（c）微管电极的轨迹设计。（d）微管电极以 β 角度下降时目标细胞漂移分析的示意图。

图19 机器人化双电极膜片钳操作流程示意图

图20 双电极全细胞记录的电生理信号。（a）细胞 1 在施加 100 pA 电流刺激下产生的动作电位（APs），触发细胞 2 中的兴奋性突触后电位（EPSPs）。(b) 在膜电位钳制于 40 mV 时，细胞 1 的离子通道电流，并在细胞 2 中产生的兴奋性突触后电流（EPSCs）。(c) 在膜电位钳制于 -70 mV 时，细胞 1 和细胞 2 产生的 EPSCs。(d) 在对细胞 1 施加从 -80 pA 到 200 pA、步长为 20 pA 的电流注入时，细胞 1 和细胞 2 的电压记录轨迹，左图为存在功能连接现象，右图为不存在功能连接现象。 (e) 在分别对细胞 1（R1 和 R3）或细胞 2（R2 和 R4）施加从 -80 pA 到 200 pA（步长为 20 pA）的电流注入时，细胞 1 和细胞 2 的电压记录轨迹。

录像6 机器人化双电极膜片钳操作过程

录像7 双电极全细胞记录

6.面向大脑皮层环境动态成像的机器人化荧光照明方法

为了实现“显示清”在体的盲环境，本项目提出了一种基于动态荧光成像建模的机器人荧光照明方法。目前，操作人员通常会小心地吹满荧光染料溶液的微管，在微管开口周围形成荧光场，照亮体内环境。这种对荧光场的手动动态控制通常是一种低精度、劳动密集型和高技能要求的任务，当微管移动以定位或接近目标细胞时，变得更具挑战性。大量的体内光照控制试验可以提高荧光领域的人工控制效率，但它们通常需要许多精确的动物样本，使其成本高昂，往往难以承受。为了提高荧光场的动态控制效率，同时降低实验成本，提出了一种基于活体动态荧光成像模拟器的机器人荧光照明控制方法。首先，建立由注射模型、扩散模型和荧光分子发光模型组成的动态荧光成像模型，模拟活体荧光场，如图21所示。通过模型得到的荧光强度分布与实验结果吻合度较高，如图22所示。基于该模型，采用自适应滑模控制器在体内环境中实现所需的荧光强度。仿真结果和实验结果均表明，与手动操作和传统PID控制器相比，该控制器在控制精度和稳态误差方面具有显著的优势，如图23和录像8所示。上述工作已经被IEEE Transactions on Automation Science and Engineering条件接收(Ruimin Li, Zhao Qili*, IEEE TASE, 22: 13716-13727, 2025)。

图21 在体荧光成像模型

图22 实验和模拟的荧光图像。(a)我们定制的双光子显微镜OX坐标系下的荧光场分布。(b)共聚焦显微镜下的荧光场分布。(c)双光子图像模拟的荧光场分布。(d)共聚焦图像模拟的荧光场分布。

图23 脑片实验动态成像实验结果

录像8 在体动态成像控制效果录像

7.面向在体膜片钳操作的微管流速精准控制方法

微量移液器出口流量的精准调控，开发了一套具备 1 帕级控制分辨率的闭环压力调控系统，如图24所示，并基于液滴法（如图25所示）建立了压力-流量关系的定量校准方法。校准结果显示，压力与流量呈线性关系，平均压力-流量增益为 4.846×10^(-17) 立方米・秒 ^(-1)・帕 ^(-1)（R²>0.99）。验证实验表明，该系统实现了目标出口流量的精准控制，流量控制误差小于 10 飞升/秒。最终，脑片环境中的应用结果证实，该系统能够维持稳定的荧光成像，荧光强度波动仅约1.3%。上述工作已经被Sensors接收(Ruimin Li, Shaojie Fu, Xin Zhao*, Sensors 2025, 25, 6647)。

图24 闭环气压调节系统。(a)系统实物图。(b)气压闭环控制框图。

图25 在 60 百帕注射压力下，液滴生长的延时成像以 20 帧为间隔记录。红色轮廓代表通过霍夫圆检测变换识别出的液滴边界。(a)初始帧。(b)第 20 帧图像。(c)第 40 帧图像。

8.基于电学引导的精准在体膜片钳操作方法

在体膜片钳是研究完整活体脑内神经元功能的“金标准”，能够直接记录膜电位及皮安级离子电流，但其前提是记录微电极必须精准接触目标细胞膜并形成吉欧级高阻封接。由于神经元在呼吸、血管搏动等生理因素影响下持续发生微小位移，传统依赖双光子成像的定位方式受到成像深度与时间分辨率之间权衡的限制，难以实现对运动细胞的实时追踪，从而影响封接成功率。针对上述问题，本文提出了一种基于微电极电阻建模的实时细胞定位方法，无需依赖视觉成像即可实现对单细胞运动的在线跟踪。为解决电阻信号噪声大、运动成分复杂的问题，进一步设计了多主频加权频率傅里叶线性组合器—卡尔曼滤波方法，对信号进行高精度去噪与状态估计，使神经元运动轨迹的平均估计误差低于0.5微米。在此基础上，本文提出相位同步捕获策略，使微电极在细胞运动周期中距离最远的位置实施推进与捕获，从而提高细胞接触稳定性并促进高阻封接形成。基于上述方法，本文构建了机器人在体膜片钳系统，并在麻醉小鼠中实现了81.8%的高阻封接成功率，显著优于既有机器人盲膜片钳系统约51%和24%的报道水平。此外，系统还在麻醉小鼠(图26)、麻醉大鼠（图27）、麻醉狨猴及清醒狨猴（图28）中获得了在体膜片钳记录，首次在清醒狨猴中实现了机器人化在体膜片钳记录。研究结果表明，该系统具备较强的跨物种适应性和跨脑状态鲁棒性，为高成功率、自动化、智能化的在体单细胞电生理研究提供了新的技术路径。上述工作已被Microsystems&Nanoengineering期刊接收（Microsystems&Nanoengineering，Ruimin Li, Qili Zhao*, and Xin Zhao*）

图26 麻醉小鼠在体机器人膜片钳实验结果。(a)采用本方法成功捕获细胞过程中的典型电流曲线（上图）、微管运动轨迹（中图）及微管尖端-细胞膜间距估算曲线（下图）。蓝色阴影区为微管快速下降至预设深度阶段；粉色阴影区为低速搜寻细胞阶段；灰色阴影区为微管尖端开口处因电阻波动检测到神经元阶段，随后连续三次步进式下探（每次下探一个深度增量，以星号标注），完成电极电阻模型的在线辨识；黄色阴影区为系统利用在线辨识得到的微管电阻模型估算神经元运动动力学，并执行精准捕获操作。(b)两种接触场景下的电流曲线放大图。（i）微管接触血管时，电阻波形呈现细密波纹并伴随高频分量，反映血管壁周期性搏动及周围组织动力学特征；（ii）与之相对，接触神经元时，电阻波形保持平滑。(c)大脑浅层与深层区域的吉欧姆封接形成率。内嵌饼图显示浅层（＜500 µm）与深层（＞500 µm）区域的巨欧姆封接概率相近（每组各40次实验）。

图27 麻醉大鼠的在体机器人膜片钳记录。(a)大鼠在体膜片钳实验操作实拍图。(b)微电极下降接触神经元时观测到的周期性微电极电阻波动。(c)细胞附近电阻波动放大图（上图），以及基于本文提出的电阻–距离模型估算的对应细胞运动轨迹（下图）。(d)电阻信号基于快速傅里叶变换（FFT）的幅值谱，在约 1.3 Hz 和约 5.9 Hz 处出现显著峰值，分别对应呼吸与心跳相关分量。(e)大鼠在体细胞贴附模式典型记录。(f)大鼠在体全细胞模式典型记录。

图28 清醒狨猴的在体机器人膜片钳记录。(a)狨猴在体膜片钳实验操作实拍图。(b)麻醉状态狨猴：细胞附近微电极电阻波动（上图）与估算细胞运动（下图）。(c)清醒状态狨猴：细胞附近微电极电阻波动（上图）与估算细胞运动（下图）。(d)狨猴电阻信号的 FFT 幅值谱：麻醉状态（上图，主频 0.2 Hz 和 3.5 Hz）与清醒状态（下图，主频 0.4 Hz 和 3.4 Hz）。(e)麻醉状态下狨猴在体细胞贴附模式典型记录。(f)清醒状态下狨猴在体细胞贴附模式典型记录。

录像9 基于电学引导的精准在体膜片钳操作方法

9.机器人化脑片和活体膜片钳操作系统的应用

1）面向机械应力敏感性离子通道兴奋性研究的机器人话双臂膜片钳系统

课题组提出了一种具有定量施加机械刺激功能的快速的机器人化的双臂膜片钳系统，用于研究脑片中神经元的机械应力敏感性兴奋性，如图18所示。首先，使用了一个结合蒙特卡洛方法的双臂膜片钳系统运动学模型，用于计算记录微电极和刺激微电极的工作空间，并优化末端执行器的长度，以减少操作期间的碰撞发生率。然后，基于压入深度控制，提出了一种利用单个微电极对细胞进行定量应力刺激的方法。最后，提出了一种基于双微电极三阶段运动控制的快速机器人化双臂膜片钳操作流程，用于接近目标细胞并形成施加定量机械应力刺激的全细胞记录，如图30，录像10和11所示。基于上述方法，课题组在小鼠脑片初级视皮层的50个锥体神经元上进行实验。结果表明，与手动操作相比，该系统的操作效率提高了三倍，接触过程的成功率提高了37%，全细胞记录的成功率提高了42%。利用这些优势，实验观察到在初级视皮层中机械刺激调节了神经元兴奋性的增强，如图31所示。实验结果还表明，钠离子电流可能比钾离子电流对机械应力刺激更敏感。系统显著提高了脑片中神经元机械刺激诱导兴奋性的研究效率，因此该方法在未来有可能用于研究机械应力敏感性离子通道功能障碍导致的致疾病的病理机制和致病机制。上述工作已经正式发表在IEEE Transactions on Biomedical Engineering 杂志上(Biting Ma, Qili Zhao*. IEEE TBME. 72(2), 2024)。

图29 机器人化双臂膜片钳系统

图30 双臂膜片钳操作流程

录像10 双电极自动接近目标细胞过程录像

录像11 细胞定量刺激与兴奋性检测录像

图31 细胞机械应力敏感兴奋性实验结果

2）机器人化活体盲法膜片钳操作

上述研究得到了国家自然科学基金国家重大科研仪器研制项目“面向清醒动物脑科学研究的机器人化主动膜片钳系统”（No.62027812, 2021.1-2025.12, 775万元）的支持。在研究过程中项目组设计加工了面向膜片钳操作的清醒动物头部主动固定装置，突破了活体神经元动态追踪技术；通过对在体环境荧光染料注射、扩散与发光建模，突破了大脑皮层环境动态荧光成像技术；基于双光子显微图像突破了大脑环境三维重建与目标障碍物精准定位技术；通过脑组织环境轨迹势场和应变建模，突破了在体环境电极主动轨迹规划与避障技术；基于膜片钳操作中多物理场建模与操作，实现了机器人化细胞紧密贴附、平稳封接、低扰动定量破膜、平衡膜片剥离和精准检测。通过关键技术集成，项目最终搭建完成了面向清醒动物的机器人化主动膜片钳系统和面向脑片与贴壁细胞的机器人化膜片钳系统，如图32所示。

图32 清醒动物（左图）和脑片（右图）的机器人化膜片钳系统

依托该系统，项目团队建立了覆盖贴壁细胞、脑片、小鼠、大鼠及清醒狨猴等多类对象的机器人化膜片钳标准操作流程，并完成了贴附式、全细胞式、穿孔式、内面朝外式和外面朝外式全部五种基本记录方式的自动化膜片钳操作流程，如图33和34所示。目前完成了超过600例贴壁细胞、125只小鼠（156个神经细胞）、17只大鼠（186个神经细胞）、15次狨猴实验（75个神经细胞）、超过1200片脑片和3000例神经细胞的电生理信号记录，如图35所示。在清醒狨猴视觉皮层感觉神经元电生理特征研究中，团队取得突破性示范应用成果，在世界范围内首次实现机器人化膜片钳清醒狨猴神经元电生理信号记录，标志着项目研制的机器人化主动膜片钳系统具备了面向清醒非人灵长类脑科学研究的实际应用能力。

图33 脑片准备过程。 (a)颅骨去除。(b)大脑摘除。(c)切片。

图34 狨猴膜片钳准备过程。(a)头部毛发剔除。(b)头环固定。(c)开颅手术。(d)挑硬脑膜。

图35 不同实验对象的机器人化膜片钳实验。(a)小鼠胎儿成纤维细胞膜片钳实验显微图像。(b)小鼠脑片视觉皮层锥体神经元实验显微图像。(c)活体小鼠膜片钳实验。(d)活体大鼠膜片钳实验。(e)清醒狨猴膜片钳实验。